月光庭院

一．模板制备




EZ DNA Methylation-Gold Kit (ZYMO RESEARCH, product number: D5005) （该公司已经破产，所以买不到该产品了。不过busulfite sequencing 试剂盒基本都差不多）

原理是Conversion Reagent将DNA序列中没有被甲基化的C变成T，甲基化的C不变。这样通过测序，将...

http://ascb.org/ibioseminars/
http://videocast.nih.gov/PastEvents.asp
http://richardjschueler.com/wp-gallery2.php?g2_itemId=56847
http://www.mc.vanderbilt.edu/discoveryseries/

好不容易试验有点起色。就赶上奥运会管制。

眼看就要歇菜啦：（

protocol由本实验室孔同学操作并记录，并成功。本人略作修改。

（一）提取DNA

1.       在液氮中磨碎拟南芥材料，各取2g粉末于高速离心管中，每管中加入20mL 已经在65℃预热过的extraction buffer（100mM Tris-HCl, pH7.5; 500mM NaCl; 50mM EDTA; 10mM β-mercaptoethanol; 1% SDS），混匀。

2.       将离心管置于65℃水浴锅30min，每隔10min拿出离心管在Vortex Shaker上振荡一下。

3.       每管加入6.67mL 5M KAc ,剧烈摇晃，冰浴20min。

4.      4℃，25000g离心20min。

5.       将上清转移到新的高速离心管，加入13.33mL异丙醇，混和，置于-20℃ 2h。

6.       4℃，25000g离心15min。

7.       将上清取出，把离心管倒置于吸水纸上干燥30min。

8.       加入2mL TE buffer将沉淀重悬，溶解，轻柔操作，4℃过夜。

9.       把DNA溶液转移至15mL离心管（转移DNA时的枪头必须剪掉尖端），4℃ 4000rpm 离心10min。

10.   将上清转移到新的15mL离心管，加入20ul 10mg/mL的RNase，在37℃烘箱放置2h。

11.   加入与管中溶液等体积的1：1的酚氯仿，混匀，4℃ 4000rpm 离心10min。

12.   将上清转移到新的15mL离心管，加入等体积氯仿，混匀，4℃ 4000rpm 离心10min。

13.   将上清转移到新的15mL离心管，加入200ul 3M NaAc和1.4mL异丙醇，混匀，置于-20℃ 2h。

14.   4℃ 4000rpm 离心30min，加入2mL75%乙醇洗涤沉淀，4℃ 4000rpm 离心10min。

15.   移去乙醇，室温下晾干30min,用200ul TE buffer溶解DNA，4℃过夜。约1-1.5ug/ul。

（二）酶切

1. 选酶原则：酶切位点在整个序列中只有一个且在探针附近，而且不能在探针序列中。在此基础上，尽量选价格便宜的酶。

酶切体系500uL（DNA 20ug）。37℃过夜。

2. 向酶切后的EP管中加入500uL氯仿，震荡混匀，4℃ 12000rpm 离心10min。

3．转移水相至新的EP管，加入两倍体积的无水乙醇和1/10体积的NaAc，震荡混匀，置于-20℃ 1h或更多时间。

4．4℃ 12000rpm 离心15min，去上清，加入400uL 75% 乙醇，弹起DNA，并在4℃ 12000rpm 离心10min。

5．在eppendorf Concentrator 中抽乙醇10min或室温凉20min。

6．加入20uL TE，4℃过夜。

（三）电泳

1．制胶：0.8%的回收胶，要求每个胶孔能全点进一种样品，0.4g溶于50mL1*TAE buffer里，只加一排梳子，不加EB。

2．点样：按照一定顺序，两个样品之间隔一个胶孔，可点Marker。

3．电泳：40V 4h，不能到溴酚兰至凝胶边缘时才停止电泳。

（四）变性               

1．染色：在EB染色盒中加入1*TAE buffer和少量EB，放入凝胶，在摇床上摇10-20min后扫胶。

2. 变性：倾去1*TAE buffer，用ddH2O冲一下凝胶，并加入适量变性液（1L:20gNaOH,87.66gNacl）,摇40min。(注意：变性不能在铝盒中进行)

3．中和：倾去变性液，用ddH2O冲一下凝胶，加入适量中和液（1L：60.5g Tris，87.66gNaCl）,摇15-30min。

（五）转膜（毛细管转移法）

在白色托盘中加入10*SSC溶液，盘中置一大制胶槽，在制胶槽上由下至上依次放置：两层与凝胶等宽但比凝胶长的滤纸，将滤纸纵向自固相支持物垂入托盘溶液中；底面朝上的凝胶（去掉点样孔及以上部分）；与凝胶等大的滤膜；铁板；5-8cm高的吸水纸；400-800g重物。凝胶下面四周用Parafilm膜包围防止短路，滤膜和滤纸事先用10*SSC溶液浸湿，转膜过夜。

注意：转膜装置中各层滤纸和膜之间要将气泡赶净，防止吸水纸倒塌和完全湿透，要及时更换吸水纸。

转膜之后可将胶置于扫胶仪中扫描，若看不见条带，说明转膜比较完全。

（六）交联

取出膜，用滤纸吸一下上面的溶液，用铅笔在膜的正面（即转上DNA的一面）做好标记。然后将膜正面向上放在滤纸上，把滤纸放进紫外交联仪中，ENERGY2000交联两次。也可以在80度烘箱中放置2小时来交联。如果不马上做下一步，可用保鲜膜将膜包起来做好标记，放在冰箱里。

（七）预杂交

配杂交液（现配现用）：每次用5mL

溶液	体积	pH
1M Na2HPO4	1.398mL
1M NaH2PO4	0.102mL
10% SDS	3.5mL
0.5M EDTA	25uL	8．0

将膜的正面向内置入杂交管，盖紧管盖，管盖内一定要有橡胶膜。把杂交液倒入杂交管，65℃杂交炉中摇3h或更久。

（八）杂交

1．在1.5mL进口管中配下列反应液（TaKaRa DNA labeling Kit）：

探针模板DNA（Kana）：1uL (10ng-1ug)

Random Primer:         2uL

dH2O(or TE buffer):     11uL(up to 14uL)

95℃加热3min后，迅速在冰上冷却5min.

2.加入2.5uL 10*buffer, 2.5uL dNTP mixture, 再加入dCTP(50uCi) 5uL（用进口黄枪头）, 有机玻璃挡板后操作，防止污染，沾过同位素的枪头要放到特定容器中。

3．加入1uL Exo-free Klenow Fragment，37℃反应10min或更久。

4．加入等体积（25uL）0.4M NaOH中止反应，37℃放置15min以上。

5．在通风橱有机玻璃将标好的探针加入到杂交管中，注意不能加到膜上，直接加入杂交液里。

6．将杂交管置于65℃杂交炉中过夜。

（九）洗膜

成分	洗膜液I	洗膜液II	洗膜液III
H20	53.7mL	56.7mL	58.2mL
20*SSC	6mL	3mL	1.5mL
20%SDS	0.3mL	0.3mL	0.3mL

1.在有机玻璃挡板后倒杂交液入指定容器，加入洗膜液I，65℃摇20min或更久。

2．打开水龙头，在有机玻璃挡板后倒掉洗膜液I，加入洗膜液 II，65℃摇20min或更久。

3．打开水龙头，在有机玻璃挡板后倒掉洗膜液 II，加入洗膜液 III，65℃摇20min或更久。

(十)压膜

将膜放在滤纸上把溶液吸干，用保鲜膜包好，正面向上放在磷屏上，压好，用便签纸写好姓名日期。

（十一）扫描结果

2-3天后将磷屏压膜的一面朝下放在扫描仪上，选定压膜的区域扫描，保存结果。扫描结束后用photoshop打开文件观察结果，存为tif格式，用U盘拷走结果。把磷屏消光15min。

 

附：洗去旧膜上探针方法

取3mL 20% SDS溶液定容到600mL，即为0.1% SDS 溶液。先取出200mL至烧杯中，在微波炉加热沸腾后置于摇床上，加入要洗的膜。等溶液温度快要降至室温时取200mL溶液煮沸，倒掉原来的溶液，加入沸腾的溶液。再重复一次之后将膜放置于滤纸上吸干溶液，即可预杂交。

 

 参考文献：

Li, J. & Chory, J. (1997) Arabidopsis protocols: Preparation of DNA from Arabidopsis. Meth Mol Biol, 82: 55-60.

extraction buffer：

20 mM Tris. HCl , pH 7.5,  100 mM NaCl,  4 mM MgCl2，0.5% NP-40，5 mM DTT，

1 tablet/10mL (Roche) protease inhibitor cocktail. * add DTT and proteinase inhibitor freshly.

1. 液氮研磨植物材料（颜色泛白为好）。

2. 按照1ml/g粉末加入提取buffer。在泡沫盒子上敲打混匀，至完全融化。

3. 4度，4000g离心15分钟。

4. 将上清转移至高速离心管，4度，20000g离心 90min。

5. 这段时间可以用未加cocktail的提取buffer预洗beads（proteinA或proteinG）三遍。每遍4度，rotate 10分 钟，1500g，离心5分钟。

6. 将上清转移至新管。（可选步骤：转移之前可以用0.45微米的滤膜过滤一下）

7. （可选步骤）按照200：1的体积加入预洗的beads。4度rotate 1小时。

8. 4度，1500g离心5分钟，取上清于新管。

9. 按照100：1的体积比加入相应的抗体（如果抗体好可以少加，事先做预试验的时候可以调试比例）。4度rotate 2小时或过夜。

10.  按照100：1的体积比加入预洗的beads。4度rotate 1小时。

11. 4度，1500g离心5分钟，弃上清。

12. 再次洗beads。同预洗的程序一样，如果用的是烟草等材料，beads可能很脏，洗至澄清为止。

13. 接下来按照不同的用途可以加蛋白电泳loading buffer煮沸，加Trizol提RNA，加cleavage buffer做切割活性或UV crosslinking等等。

14. 如果待分离蛋白是TAP标签，beads则用IGG，省去第9步，将第10步改为2小时即可。

1. 种本生烟（Nicotiana benthamiana）。25℃，14h光照；20℃，10h黑暗。一个月后可用。

2. 小摇农杆菌16-24小时。

3.按照1：100转接到下列培养液中，28℃ 16-24小时。

10.5 g/l K₂HPO₄, 4.5 g/l KH₂PO₄, 1.0 g/l (NH₄)₂SO₄, 0.5 g/l NaCitrate·2H₂O, 1 mM MgSO₄·H₂0, 0.2% glucose, 0.5% glycerol, 50 μM acetosyringone (Aldrich), and 10 mM N-morpholino-ethanesulfonic acid (MES) (pH 5.6) 。非红色字体溶液高压灭菌后，冷却，加入过滤除菌的红色字体溶液。当然别忘了加适当的抗生素。

4. 集菌，用下列溶液重悬农杆菌至OD600=0.5~0.6.

 MS，10 mM MES medium （pH 5.6）， 150 μM acetosyringone

5. 用1ml的一次性注射器将菌液打入烟草叶片背面。 如果要用叶片来提取蛋白，那第5步将是一个十分痛苦的过程（试过就知道，吐血含泪推荐打烟草条件：温度26-30℃，天气十分晴朗，下午两点到五点）。如果只是观察一下GFP之类的，那倒没啥。

6. 打完后灌水，隔两天将烟草咔嚓之。

参考文献：

Van den Ackerveken, G., Marois, E., and Bonas, U. (1996). Recognition of the bacterial avirulence protein AvrBs3 occurs inside the host plant cell. Cell 87, 1307-1316. 

1. 离心力一般不要超过3000g。（现在也有一些小型超滤管离心力可到12000g）

2. 待浓缩除盐的样品在离心之前要过滤除菌。

3. 使用后用灭菌水洗涮干净，加入灭菌水后保存在4°C冰箱。（可外加0.05%的叠氮化钠）

参考： 

http://www.myresearchspace.cn/bbs/viewthread.php?tid=126025 

Inoue法制备超级感受态细胞

越干净越好，越冷越好

 

1.      将洗干净的瓶子（500ml三角烧瓶）用Milli-Q水浸泡2-3小时，倒去烧瓶中的水并将烧瓶倒扣在吸水纸上2-3分钟。用Milli-Q水配置250ml LB液体培养基。高压灭菌。

2.      准备两盒1.5ml EP管，每盒中放置两张吸水纸，共约两百个。高压灭菌。

3.      于早晨7-8点钟小摇菌种，挑取单菌落于5ml Milli-Q水配置且灭菌的LB液体培养基（无抗性）中，37℃培养12小时以上（OD600大于1.5）。可以用一个新的50ml 进口离心管（costa，BD等品牌都可以）来摇细菌。

4.      晚上10点钟左右，按1：100大摇细菌。超静台内吸取2.5ml小摇细菌于高压灭菌的250ml培养基（无抗性）中， 18-22℃，200rpm摇过夜。

5.      第二天上午测量细菌OD600值。Top10, Jm109等生长速度快的细菌约在上午9点左右OD600达到0.55左右，DH5α则要到下午4-6点钟（新手可以多摇几瓶细菌，梯度接菌，如1：50，1：100，1：200等，哪瓶到了用哪瓶，其它的可以狠心倒掉）。

6.      将OD600达到0.55的细菌置于冰上10min（OD600在0.4-0.8之间都可以，对结果影响不大）。

7.      4℃，4000rpm，10min集菌（用新的50ml 进口离心管）。

8.      超静台内弃上清，将管倒扣在事先灭好的吸水纸上，巨大力向下击打，尽可能去掉剩余LB。

9.      每管倒入10ml 预冷的Inoue转化缓冲液，拧紧盖子。在冰上来回滑动重悬细菌（重悬的时间与向下击打的力度和来回滑动的速度相关，这两者于感受态效率没有直接关系）。

10.  超静台内向每管倒入约30ml 预冷的Inoue转化缓冲液，来回颠倒混匀。

11.  4℃，4000rpm，10min集菌。

12.  超静台内弃上清，将管倒扣在事先灭好的吸水纸上（换一张吧，别用刚才那张），巨大力向下击打，尽可能去掉剩余缓冲液。

13.  每管倒入10ml 预冷的Inoue转化缓冲液，拧紧盖子。在冰上来回滑动重悬细菌。

14.  超静台内向每管加入750μl DMSO。轻轻来回混匀（记住要轻轻）。置于冰上10min。

15.  将冰浴的感受态细胞分装到事先灭菌后并放到-20或4℃的EP管中，一个一个丢到液氮罐里，然后冻到-80（分装的体积是爱分多少分多少，建议100μl每管，传说液氮速冻可以提高5倍的感受态效率）。

16.  按人品的好坏，感受态效率在10⁸-10⁷不等。

 

 

 

 

 

 

 

 

溶液配置：

0.5M PIPES                            100ml

PIPES                                      15.1g

用5M KOH调pH到6.7，然后用0.45μm的滤膜过滤除菌。

（PIPES似乎有PIPES酸和PIPES盐之分，如果你配好溶液后，测量的pH大于6.7，千万不要惊慌，可以用HCl调回到6.7，不影响结果的）

 

Inoue转化缓冲液                                          1000ml

MnCl₂.4H₂O                                                 10.88g

CaCl₂.2H₂O                                                  2.2g

KCl                                                                18.65g

PIPES，0.5M pH6.7                                   10ml

H₂O                                                               补至1000ml

用0.45μm的滤膜过滤除菌。

 

 

Reference:

J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔 著，黄培堂 等译，制备和转化感受态大肠杆菌的Inoue方法：制备超级感受态细胞，分子克隆实验指南（第三版），2002，93-96。

    落地生根 Bryophyllum pinnatum (L.) Oken (Air-plant)，景天科 Crassulaceae，落地生根属 Bryophyllum。原产: 非洲（马达加斯加），一年生草本植物。可观赏，入药，其汁液有毒性。

第一张显示，母本成熟叶片上长有很多子代个体。

第二张是子代个体上长有第三代个体的特写（这张是由同实验室的Jingrui Li拍摄的）。

中央10台做过一个马云的专访，让我了解了一点关于他的信息。04发现，看护到05年4月。期间被怀疑，冷落，疏远，饥寒，病痛，女朋友离开，等等。可以说是为了这个化石，倾其所有。 

6月14日的nature刊登了该灵武类鸟恐龙的文章，但文章中没有闪现该龙化石的发现和看护者---马云的名字，半个字眼也没有，材料和致谢中均没有。

居然还有这样的报道，http://tech.sina.com.cn/d/2007-06-14/05321561893.shtml

“专家无意中发现化石

　　据悉，“二连巨盗龙”的发现纯属偶然——2005年4月，著名恐龙专家徐星博士在恐龙化石所在的盆地进行常规普查时，偶然发现一块化石，之后又在周边发现了几块骨头化石，经过两年多时间的研究、修理，最终确定这是一具巨型恐龙的化石。”

悲哀呀：（

中国人道德素养不回复，知识产权永远保护不了。