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2006-10-31
原生质体转化相关质粒提取方法 - [生物学]
对于PEG介导的原生质体转化实验，质粒的质量非常重要。我下面就介绍一下我用的质粒提取方法。
用北京博大泰克生物基因技术有限责任公司的B 型质粒小量提取试剂盒，完全按照其protocol进行提取，但有以下几点改动：
1. 小摇细菌OD600最好大于1.5，每1.5ml EP管集菌3ml，每种质粒提两管。
2. 溶液2后冰上2分钟，溶液3后冰上8分钟。
3. 洗脱完，空甩2分钟后，用枪吸干过滤柱顶端的残留液体。
4. 用40ul dd水洗脱第一管，再用第一管离心后的溶液洗脱第二管。
最后体积大概是30ul多一点。全部用于一次原生质体转化。
注意：质粒最好现提，不要放置多于两天。
本人不是博大泰克的，呵呵！
最近用Qiagen的小提也可以.
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祝天底下所有的小朋友们，大朋友们节日快乐。
想起小学的时候，每次六一我们都要到乡里中心小学庆祝，然后到大礼堂看电影。但是电影开始之前不同的学校之间要拉歌。而我们小学只有语文和数学课，像什么音乐，体育等都没有。可想而知，每次我们到后来都是没歌可唱。于是就有人高喊：××小学丢脸不丢脸？众人高答：丢脸。
唉，没想到六一节的记忆竟然这么惨痛：（不知道现在我那母校有没有音乐课了？也希望不再有这种喊-答。
现在我倒是不一样了，什么歌都会哼两句了。可惜不管用啊。
不过，六一那天倒是可以吃到很好吃馒头，还有很稀罕的电影：）唉，乐趣一点点。 -
2006-05-28
差距很小的DNA片段琼脂糖凝胶分离方法 - [生物学]
适用于大小在50-500bp，差距在10-50bp的DNA片段分离。一般在mapping的时候常常用到。
1. 选用西班牙biowest的普通型琼脂糖。100g-300元左右。（如果有钱当然可以用更好的低熔点低黏点琼脂糖，biowest,takara，bio-rad等都有卖）
2. 配4%的胶。（可用微波炉最低火慢慢加热10-30分钟，待摇晃后无明显气泡为止，用高火容易溢出且不能完全熔化）
3. 低电压60v左右跑30-60分钟。 -
妈妈，一九八六年二月初九
爷爷，二零零四年
奶奶，二零零六年二月初一
走完了各自人生的驿站：（ -
1. 取开势很好（花完全展开，呈十字状，雄蕊很黄）的花作为父本。 2. 取刚露白（能看见一点白色花瓣）的花作为母本。 3. 用特小型镊子小心的去掉母本花的花萼（绿色部分），撑开花瓣，去掉 雄蕊（呈微黄色）。（首先用镊子头部小心的沿着花苞的方向拨弄几下，把花苞拨松，去掉绿色的花萼，用镊子把白色花瓣撑开，把微黄色的雄蕊剥掉，拨一下后就在纸上擦干净镊子，注意不要碰到中间的柱头） 4. 取下父本花的雄蕊，在母本花的柱头上轻轻擦拭数次。标记好做过杂交的这朵花。 （因为开势很好，雄蕊很明显，用镊子夹住雄蕊柄部取下）5. 过两三天，如果母本花能发育长大则表明杂交成功。 请教于实验室小蔡。
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2006-01-15
PEG介导拟南芥叶片原生质体瞬时表达方法 - [生物学]
说来惭愧，硕博五年，最擅长的试验技能只有这一项。摸索了大约一年多。有时候感觉自己很笨
PEG介导拟南芥叶片原生质体瞬时表达方法
1. B5培养基上萌发拟南芥种子，待根长至1-3厘米时即可移栽到土里，温室培养，光照12h/12h，150μE。
2. 准备好一个90mm培养皿，称1.82克D－甘露醇于20ml双蒸水中。培养皿的盖子用来切叶片。
3. 取4周后未抽台前的叶片，约90片。切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液中。可以一边切一边从植株上取。
4. 配酶解液，100ml三角瓶，15ml酶解体系。
5. 将步骤3中细条捞出，置于酶解液中。黑暗，23℃，40-50rpm酶解3小时。
6. 酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于15ml离心管（直径约1cm）中，均分为两管。4℃，60 g，15min，brake 设为4-5。
7. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。4℃，100 g，1min，brake 设为4-5。
8. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。冰上放置30min。
9. 23℃，100 g，1min，brake 设为4-5。弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬。（本步骤及以下操作均在23℃。）
10. 取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤9中的原生质体。用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀。
11. 加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀。放置20-30min。
12. 加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀。23℃，100 g，1min，brake 设为4-5。
13. 弃上清，加100ul W5，混匀。加900ul W5，混匀。
14. 上述混合液体置于六孔板内，23℃，弱光，孵育6-18小时。
15. 荧光观察，观察之前100g，常温，离心2分钟，终体积控制在50ul左右。
Solution Recipes
Enzyme solution
1ml 15％cellulase R10 (RS is too strong)
1ml 4.5％macerozyme R10 (Yakult Honsha, Tokyo, Japan)
1.09 g mannitol
1ml 0.3M KCl
1ml 0.3M MES, pH 5.7
Heat the enzyme solution at 55oC for 10 min (to inactivate proteases and enhance enzymesolubility) and cool it to room temperature before adding
1ml 0.15M CaCl2
1ml 0.75mM β-mercaptoethanol
1ml 1.5% BSA
PEG solution (40%, v/v)
1 g PEG4000 (Fluka, #81240) **Very Important!!
0.75 ml H2O
0.625 ml 0.8 M mannitol
0.25 ml 1M CaCl2
W 5
1000 ml
154 mM NaCl 9.0 g
125 mM CaCl2 18.4 g
5 mM KCl 0.37 g
5 mM glucose 0.9 g
0.03% MES 0.3 g
pH to 5.8 with KOH
autoclave 20 minutes in 125 bottles
MaMg solution
100 ml
15 mM MgCl2 1.5 ml 1M MgCl2
0.1% MES 0.1 g
0.4 M mannitol 7.3 g
pH to 5.6 with KOH
autoclave 20 minutes in 125 ml bottles
References
1. Sheen, J. 2002, A transient expression assay using Arabidopsis mesophyll protoplasts. http://genetics.mgh.harvard.edu/sheenweb/
2. Doelling & Pikaard. 1993, Transient expression in Arabidopsis thaliana protoplasts derived from rapidly established cell suspension cultures. Plant Cell Reports 12: 241-244
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2005年真的是极其糟糕的一年。
坏的运气都带到今年了：（
都说否极泰来，希望如此。
不能光责怪运气，反思与改正是最为重要的。
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唉，酵母双杂还是没有结果，准备换一种方法试试，以前用的是clontech的方法。现在准备用国产的北京一家公司的方法。
1． 小摇10ml酵母，30℃，250rpm，16-18小时。
2． 转接到50ml培养基中，使OD600＝0.2-0.3
3． 30℃，摇到OD600为0.5，约3-5小时。
4． 20℃，1000g，5min，离心。弃上清。用10ml灭菌ddH2O洗涤.
5． 同样条件离心，弃上清。用1ml 1×TE-LiAc（0.1ml 10×LiAC，0.1ml 10×TE，0.8ml ddH2O）重悬。
6． 30℃，摇床，30min，250rpm。
7． 取2-5ug质粒，10ug carrier DNA，混匀。
8． 加入200ul 步骤6中的细胞，混匀。
9． 加入100ul 10×LiAc，100ul 10×TE，800ul 50％ PEG4000，剧烈振荡混匀.
10． 30℃，摇床，30min，250rpm.
11． 42℃，水浴，15min。冰上1-2min.
12． 高速离心，3-5s，去上清.
13． 0.5ml ddH2O 洗涤两次，打散混匀.
14． 离心，去上清，用1.0ml ddH2O重悬.
15． 涂板。
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2006-01-06
酵母双杂，真难杂：（ - [生物学]
这段时间一直在做酵母双杂，但就是不出现蓝斑。
不知道是不相互作用还是实验的问题。准备明天重新换换条件。
要是有结果了，过几天把心得写上来
月光庭院
@月光如水-_-庭院深深@
