月光庭院

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1.  将某要定点突变的片段连接到一个小载体中，比如T载体。

2.    在将要突变的位点处设计两条完全互补的引物，例子：

GCCACCAGCTCAAGAACTGATTGCAAGGGATCTCCATGATGTTGAATGGAAGTTTAGGCATATCTTTCGGGGA

CAGCCCAAACGGCATCTCCTAACTACTGGATGGAGTGTCTTTGTCAGTGCCAAGCGACTAGTAGCTGGAGATT

CTGTCATTTTCATCAGGAATGAAAAGAATCAACTCTTTTTGGGAATTCGTCATGCCACTCGGCCGCAGACTATT

GTACCATCATCTGTTTTATCTAGTGATAGCATGCATATTGGACTCCTTGCTGCTGCTGCACATGCTTCTGCAAC

TAATAGCTGTTTCACTGTTTTCTTTCATCCAAGGGCTAGCCAATCTGAGTTTGTGATACAACTTTCCAAGTACAT

TAAAGCCGTTTTTCACACGCGTATTTCAGTTGGGATGCGCTTTCGCATGCTCTTCGAGACAGAAGAGTCGAGT

GTCCGCAGGTACATGG

在这段序列中将第127位的G突变为A。到网站http://www.stratagene.com/qcprimerdesign 注册一个免费账号，按照提示上传上面这段序列。上传成功后，在第5步，选择将要突变位点的个数，以及突变后的碱基。然后在下面方框中勾上原序列片段的将要突变的碱基位置。点击 Design primer即可。

得到引物序列：

g127a           5'-tgtctttgtcagtgccaaacgactagtagctggag-3'

g127a_antisense 5'-ctccagctactagtcgtttggcactgacaaagaca-3' （红色标记是突变的部分）

3.      用高保真pfu(最好用好点的酶),如stratagene的PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase（600380）或者PfuTurbo® Hotstart DNA Polymerase（600320），NEB的Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase （F-530L），有时候自己做的pfu也很好用，但是TAKARA的pyrobest就不太好用。

4.  按照这个体系做PCR：

5 μl of 10× reaction buffer

X μl (5–50 ng) of dsDNA template

X μl (125 ng) of oligonucleotide primer #1

X μl (125 ng) of oligonucleotide primer #2

1 μl of dNTP mix

ddH₂O to a final volume of 50 μl

Then add

1 μl of Pfu DNA polymerase (2.5 U/μl)

95°C 30 s

95°C 30 s

55°C 1 min    可以改变

68°C 1 min/kb of plasmid length

扩增18个cycles。

5.       PCR做完以后，加1μl Dpn I 内切酶（NEB，R0176L），37度消化4-5个小时。

6.       取10μl左右转化大肠杆菌。

7.       挑取克隆去测序，一般来说，长出来的克隆都是突变过来的。如果没有突变过来则检查引物设计先；如果不长斑，改变PCR条件和改变引物序列试试。