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2008-03-19
small RNA 领域竞争惨烈 - [闲话]
最近我们实验室有一篇paper在cell online了。说的是植物中sRNA进入不同AGO蛋白的分拣机制。去年七月份开始做，11-01投一稿，02-15接收。其间，老板那叫一个push啊：（
哭劝：不是爱好就别做生物啊。
同一天（03-13）Carrington JC也有一篇cell online。两篇文章有一些共同涉及的部分。要是他们先发，我们的就只能降一个档次发了。如果我们先发对他们的影响不大。
老板说起过直到online之前他压根就不知道Carrington他们也有类似的文章，但知道日本有一个实验室发现了类似的规律。今天终于发现日本那个实验室把他们的paper发到了Plant Cell Physiol.上面，14号online的。
老板名言录：
“什么十一，星期六日都没有。” “不是说你做不出来，而是说你什么时候做出来，晚了就啥都不是。”
1: Mi S, Cai T, Hu Y, Chen Y, Hodges E, Ni F, Wu L, Li S, Zhou H, Long C, Chen S, Hannon GJ, Qi Y.
Sorting of Small RNAs into Arabidopsis Argonaute Complexes Is Directed by the 5' Terminal Nucleotide.
Cell. 2008 Mar 12; [Epub ahead of print]
PMID: 18342361
2: Montgomery TA, Howell MD, Cuperus JT, Li D, Hansen JE, Alexander AL, Chapman EJ, Fahlgren N, Allen E, Carrington JC.Specificity of ARGONAUTE7-miR390 Interaction and Dual Functionality in TAS3 Trans-Acting siRNA Formation.
Cell. 2008 Mar 12; [Epub ahead of print]
PMID: 18342362
3: Takeda A, Iwasaki S, Watanabe T, Utsumi M, Watanabe Y.The mechanism selecting the guide strand from small RNA duplexes is different among Argonaute proteins.
Plant Cell Physiol. 2008 Mar 14; [Epub ahead of print]
PMID: 18344228 -
1. takara 宝生物相关 如 pMD18 pMD19等
http://www.takara.com.cn/product/p_6/default.asp
2. novagen 表达相关 如pET30 系列等
http://www.ebiotrade.com/buyf/productsf/Novagen/index.htm#1
3. 这个网站也有很多vector的序列
http://www.genomex.com/aexVectors.php?page=1&limit=40
4. gateway 相关pMDC32 系列等
http://www.unizh.ch/botinst/Devo_Website/curtisvector/index_2.html
5. pCAMBIA 系列 如pCAMBIA1300 等
http://cambia.org/daisy/cambia/601.html
6. RNAi 系列 如 pFGC5941等
http://www.chromdb.org/rnai/order_vectors.html
7. pGreen系列载体 如pGreen0179等
http://www.pgreen.ac.uk/JIT/JIT_fr.htm
8. 一个很牛的vector网站
http://www.addgene.org/pgvec1?cmd=listvecinfo&f=v
还有一些其它零散的，下次放上来。如 pBI121 pEGDA等。
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2007-03-07
“走别人的路，让别人无路可走” - [生物学]
这是去年网络上最拽叱的签名档之一。看了后一笑了之，但最近发现科技前沿中也有其事。
RNA interfrence （RNA干扰，也称RNAi）是九几年被揭秘的生命现象之一，最近更是热的烫手。本人也是一头扎入其中。06年的炸药奖更是从某种角度证明了它的重要性。比如，可以用它来研究基因的功能，可以特异的改变生物的某种性状，从而很好的达到商业应用的目的。当然如果没有商业用途，人们也不会拼死去研究它。
RNAi是生物体对自身发育调控和防御病毒入侵等进化出来的一套机制，有着完整的诱发... -
2006-11-28
搬家四－－－酵母双杂 - [生物学]
今天又做酵母双杂了，祈祷ing
换了一个系统，这个系统更适合于膜蛋白的相互作用。希望有结果啊！
其实应该更早点考虑到实验系统的适应范围问题，唉！时间就是这么浪费的。2006年04月20日 4:57 PM
酵母双杂终于是修成正果
运气还算不错，毕业前夕实验更进了一步。
刚开始做这两个蛋白的相互作用选用的是BD公司的双杂系统。现在用的是dualsystems的系统。前者适合于可溶性蛋白，后者适合于膜蛋白的相互作用研究。只是在构建载体时要复杂一些，首先对兴趣蛋白的N端和C端通过网站（链接里面有网址）预测它们位于胞质还是胞质外（包括间质和细胞器内），然后选择合适的vector构建所需的bate和prey载体。具体方法：www.dualsystems.com有说明书可以下载。
构建好载体后，就是转化了，可以两个载体共转化酵母。最后的筛选是在三缺板上，必须加3-AT。
最后显色的方法也较为简单：
1. 使用新鲜转化的酵母板作显色反应。
2.把未加x-Gal的显色液放入50度水浴30-60min。
3.裁取大小合适的3-MM whatman滤纸铺在酵母板上10min，做好标记。
4.用镊子小心取出放在液氮中浸泡5min。
5.取出放置培养皿中，克隆面朝上，室温溶化5min。
6.加x-Gal于50度左右的显色液中，摇匀。
7.铺上显色液，室温至蓝色出现。一般30min即可。显色液：1×PBS（pH7.4）；0.5％ agarose；（现用微波炉或电炉加热溶化）100mg/L x-Gal
p.s. 照相最好用三脚架。
2006年04月25日 8:23 PM
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2006-11-10
拟南芥原生质体转化视频文件 - [生物学]
最近在JEN SHEEN LAB网站上发现他们上传了一个拟南芥原生质体转化视频文件。
讲得非常详细，也可以边听听英文讲解
进入protocols
然后点击 ASPB2006 protoplast workshop movie，注册一下就可以下载了。 -
2006-11-05
原生质体转化关键因素 - [生物学]
说实话,原生质体转化关键因素很多,我做这个实验就摸索了将近一年时间.但成功之后又觉得不是那么复杂.
我觉得关键的因素:
1. 我用的材料是拟南芥,最好是未抽台,长势良好的.不要用发褐,变黄的叶片.这一点对原生质体的完整性很重要.
2. 质粒的量要多一点,一次转化,我一般集菌3ml,最后用40ul水洗两个柱子(洗完一个,用离心下来的溶液洗另外一个).
3. PEG的型号,我只用过Jen Sheen推荐的那种.
4. 操作上要轻柔,离心力不要超过100g,但是PEG与原生质体混匀的那一步必须用枪吸打(先用剪刀剪去枪头前端小部分).
5. 当然还有一个前提条件是载体序列正确. -
2006-10-31
原生质体转化相关质粒提取方法 - [生物学]
对于PEG介导的原生质体转化实验，质粒的质量非常重要。我下面就介绍一下我用的质粒提取方法。
用北京博大泰克生物基因技术有限责任公司的B 型质粒小量提取试剂盒，完全按照其protocol进行提取，但有以下几点改动：
1. 小摇细菌OD600最好大于1.5，每1.5ml EP管集菌3ml，每种质粒提两管。
2. 溶液2后冰上2分钟，溶液3后冰上8分钟。
3. 洗脱完，空甩2分钟后，用枪吸干过滤柱顶端的残留液体。
4. 用40ul dd水洗脱第一管，再用第一管离心后的溶液洗脱第二管。
最后体积大概是30ul多一点。全部用于一次原生质体转化。
注意：质粒最好现提，不要放置多于两天。
本人不是博大泰克的，呵呵！
最近用Qiagen的小提也可以.
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2006-05-28
差距很小的DNA片段琼脂糖凝胶分离方法 - [生物学]
适用于大小在50-500bp，差距在10-50bp的DNA片段分离。一般在mapping的时候常常用到。
1. 选用西班牙biowest的普通型琼脂糖。100g-300元左右。（如果有钱当然可以用更好的低熔点低黏点琼脂糖，biowest,takara，bio-rad等都有卖）
2. 配4%的胶。（可用微波炉最低火慢慢加热10-30分钟，待摇晃后无明显气泡为止，用高火容易溢出且不能完全熔化）
3. 低电压60v左右跑30-60分钟。 -
1. 取开势很好（花完全展开，呈十字状，雄蕊很黄）的花作为父本。 2. 取刚露白（能看见一点白色花瓣）的花作为母本。 3. 用特小型镊子小心的去掉母本花的花萼（绿色部分），撑开花瓣，去掉 雄蕊（呈微黄色）。（首先用镊子头部小心的沿着花苞的方向拨弄几下，把花苞拨松，去掉绿色的花萼，用镊子把白色花瓣撑开，把微黄色的雄蕊剥掉，拨一下后就在纸上擦干净镊子，注意不要碰到中间的柱头） 4. 取下父本花的雄蕊，在母本花的柱头上轻轻擦拭数次。标记好做过杂交的这朵花。 （因为开势很好，雄蕊很明显，用镊子夹住雄蕊柄部取下）5. 过两三天，如果母本花能发育长大则表明杂交成功。 请教于实验室小蔡。
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2006-01-15
PEG介导拟南芥叶片原生质体瞬时表达方法 - [生物学]
说来惭愧，硕博五年，最擅长的试验技能只有这一项。摸索了大约一年多。有时候感觉自己很笨
PEG介导拟南芥叶片原生质体瞬时表达方法
1. B5培养基上萌发拟南芥种子，待根长至1-3厘米时即可移栽到土里，温室培养，光照12h/12h，150μE。
2. 准备好一个90mm培养皿，称1.82克D－甘露醇于20ml双蒸水中。培养皿的盖子用来切叶片。
3. 取4周后未抽台前的叶片，约90片。切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液中。可以一边切一边从植株上取。
4. 配酶解液，100ml三角瓶，15ml酶解体系。
5. 将步骤3中细条捞出，置于酶解液中。黑暗，23℃，40-50rpm酶解3小时。
6. 酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于15ml离心管（直径约1cm）中，均分为两管。4℃，60 g，15min，brake 设为4-5。
7. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。4℃，100 g，1min，brake 设为4-5。
8. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。冰上放置30min。
9. 23℃，100 g，1min，brake 设为4-5。弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬。（本步骤及以下操作均在23℃。）
10. 取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤9中的原生质体。用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀。
11. 加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀。放置20-30min。
12. 加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀。23℃，100 g，1min，brake 设为4-5。
13. 弃上清，加100ul W5，混匀。加900ul W5，混匀。
14. 上述混合液体置于六孔板内，23℃，弱光，孵育6-18小时。
15. 荧光观察，观察之前100g，常温，离心2分钟，终体积控制在50ul左右。
Solution Recipes
Enzyme solution
1ml 15％cellulase R10 (RS is too strong)
1ml 4.5％macerozyme R10 (Yakult Honsha, Tokyo, Japan)
1.09 g mannitol
1ml 0.3M KCl
1ml 0.3M MES, pH 5.7
Heat the enzyme solution at 55oC for 10 min (to inactivate proteases and enhance enzymesolubility) and cool it to room temperature before adding
1ml 0.15M CaCl2
1ml 0.75mM β-mercaptoethanol
1ml 1.5% BSA
PEG solution (40%, v/v)
1 g PEG4000 (Fluka, #81240) **Very Important!!
0.75 ml H2O
0.625 ml 0.8 M mannitol
0.25 ml 1M CaCl2
W 5
1000 ml
154 mM NaCl 9.0 g
125 mM CaCl2 18.4 g
5 mM KCl 0.37 g
5 mM glucose 0.9 g
0.03% MES 0.3 g
pH to 5.8 with KOH
autoclave 20 minutes in 125 bottles
MaMg solution
100 ml
15 mM MgCl2 1.5 ml 1M MgCl2
0.1% MES 0.1 g
0.4 M mannitol 7.3 g
pH to 5.6 with KOH
autoclave 20 minutes in 125 ml bottles
References
1. Sheen, J. 2002, A transient expression assay using Arabidopsis mesophyll protoplasts. http://genetics.mgh.harvard.edu/sheenweb/
2. Doelling & Pikaard. 1993, Transient expression in Arabidopsis thaliana protoplasts derived from rapidly established cell suspension cultures. Plant Cell Reports 12: 241-244
月光庭院
@月光如水-_-庭院深深@
