• 2006-11-10

    拟南芥原生质体转化视频文件 - [生物学]

    最近在JEN SHEEN LAB网站上发现他们上传了一个拟南芥原生质体转化视频文件。
    讲得非常详细，也可以边听听英文讲解
    进入protocols
    然后点击 ASPB2006 protoplast workshop movie，注册一下就可以下载了。
    Tag：分子生物学 原生质体 视频
    yemiaochen 发表于18:04:50 | 阅读全文 | 评论5 | 编辑 | 分享 0

  • 2006-11-05

    原生质体转化关键因素 - [生物学]

    说实话,原生质体转化关键因素很多,我做这个实验就摸索了将近一年时间.但成功之后又觉得不是那么复杂.
    我觉得关键的因素:
    1. 我用的材料是拟南芥,最好是未抽台,长势良好的.不要用发褐,变黄的叶片.这一点对原生质体的完整性很重要.
    2. 质粒的量要多一点,一次转化,我一般集菌3ml,最后用40ul水洗两个柱子(洗完一个,用离心下来的溶液洗另外一个).
    3. PEG的型号,我只用过Jen Sheen推荐的那种.
    4. 操作上要轻柔,离心力不要超过100g,但是PEG与原生质体混匀的那一步必须用枪吸打(先用剪刀剪去枪头前端小部分).
    5. 当然还有一个前提条件是载体序列正确.
    Tag：分子生物学 原生质体 关键因素
    yemiaochen 发表于14:25:09 | 阅读全文 | 评论4 | 编辑 | 分享 0

  • 2006-10-31

    原生质体转化相关质粒提取方法 - [生物学]

    对于PEG介导的原生质体转化实验，质粒的质量非常重要。我下面就介绍一下我用的质粒提取方法。

    用北京博大泰克生物基因技术有限责任公司的B 型质粒小量提取试剂盒，完全按照其protocol进行提取，但有以下几点改动：

    1. 小摇细菌OD600最好大于1.5，每1.5ml EP管集菌3ml，每种质粒提两管。
    2. 溶液2后冰上2分钟，溶液3后冰上8分钟。
    3. 洗脱完，空甩2分钟后，用枪吸干过滤柱顶端的残留液体。
    4. 用40ul dd水洗脱第一管，再用第一管离心后的溶液洗脱第二管。
        最后体积大概是30ul多一点。全部用于一次原生质体转化。

    注意：质粒最好现提，不要放置多于两天。
                本人不是博大泰克的，呵呵！
    最近用Qiagen的小提也可以.
    Tag：分子生物学 原生质体 质粒 博大泰克
    yemiaochen 发表于18:21:12 | 阅读全文 | 评论1 | 编辑 | 分享 0

  • 2006-01-15

    PEG介导拟南芥叶片原生质体瞬时表达方法 - [生物学]

    说来惭愧，硕博五年，最擅长的试验技能只有这一项。摸索了大约一年多。有时候感觉自己很笨

     

     

    PEG介导拟南芥叶片原生质体瞬时表达方法

     

     

     

    1. B5培养基上萌发拟南芥种子，待根长至1-3厘米时即可移栽到土里，温室培养，光照12h/12h，150μE。

     

    2. 准备好一个90mm培养皿，称1.82克D－甘露醇于20ml双蒸水中。培养皿的盖子用来切叶片。

     

    3. 取4周后未抽台前的叶片，约90片。切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液中。可以一边切一边从植株上取。

     

    4. 配酶解液，100ml三角瓶，15ml酶解体系。

     

    5. 将步骤3中细条捞出，置于酶解液中。黑暗，23℃，40-50rpm酶解3小时。

     

    6. 酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于15ml离心管（直径约1cm）中，均分为两管。4℃，60 g，15min，brake 设为4-5。

     

    7. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。4℃，100 g，1min，brake 设为4-5。

     

    8. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。冰上放置30min。

     

    9. 23℃，100 g，1min，brake 设为4-5。弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬。（本步骤及以下操作均在23℃。）

     

    10. 取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤9中的原生质体。用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀。

     

    11. 加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀。放置20-30min。

     

    12. 加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀。23℃，100 g，1min，brake 设为4-5。

     

    13. 弃上清，加100ul W5，混匀。加900ul W5，混匀。

     

    14. 上述混合液体置于六孔板内，23℃，弱光，孵育6-18小时。

     

    15. 荧光观察，观察之前100g，常温，离心2分钟，终体积控制在50ul左右。

     

     

     

    Solution Recipes

     

    Enzyme solution

    1ml 15％cellulase R10 (RS is too strong)

    1ml 4.5％macerozyme R10 (Yakult Honsha, Tokyo, Japan)

    1.09 g mannitol

    1ml 0.3M KCl

    1ml 0.3M MES, pH 5.7

    Heat the enzyme solution at 55oC for 10 min (to inactivate proteases and enhance enzymesolubility) and cool it to room temperature before adding

    1ml 0.15M CaCl2

    1ml 0.75mM β-mercaptoethanol

    1ml 1.5% BSA

     

     

    PEG solution (40%, v/v)

    1 g PEG4000 (Fluka, #81240) **Very Important!!

    0.75 ml H2O

    0.625 ml 0.8 M mannitol

    0.25 ml 1M CaCl2

     

     

    W 5

    1000 ml

    154 mM NaCl 9.0 g

    125 mM CaCl2 18.4 g

    5 mM KCl 0.37 g

    5 mM glucose 0.9 g

    0.03% MES 0.3 g

    pH to 5.8 with KOH

    autoclave 20 minutes in 125 bottles

     

     

     

    MaMg solution

    100 ml

    15 mM MgCl2 1.5 ml 1M MgCl2

    0.1% MES 0.1 g

    0.4 M mannitol 7.3 g

    pH to 5.6 with KOH

    autoclave 20 minutes in 125 ml bottles

     

     

    References

     

    1. Sheen, J. 2002, A transient expression assay using Arabidopsis mesophyll protoplasts. http://genetics.mgh.harvard.edu/sheenweb/

    2. Doelling & Pikaard. 1993, Transient expression in Arabidopsis thaliana protoplasts derived from rapidly established cell suspension cultures. Plant Cell Reports 12: 241-244

     

     

    Tag：分子生物学 拟南芥 原生质体 转化 PEG
    yemiaochen 发表于17:34:57 | 阅读全文 | 评论10 | 编辑 | 分享 0
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